近些年来，菌种酱香基酒基吡酱香型白酒以其配合的强化嗪含感官风韵以及加倍舒适的饮后体征感触，越来越受到破费者的散漫喜爱。酱香型白酒的工艺酒体中搜罗了种类加倍丰硕的风韵物资以及生物活性组分，如四甲基吡嗪（tetramethylpyrazine，优化TTMP），后退近些年来受到普遍的白酒关注，被以为是中甲钻研与酱香气焰亲密相关的物资，同时也是菌种酱香基酒基吡行业中公认的“瘦弱因子”，具备削减脑血管的强化嗪含血流量，削减脑缺血性疾病的散漫爆发、改善学习的工艺拦阻、防止由无水乙醇引起的优化胃粘膜伤害以及肾中毒、防止由硫代乙酰胺引起的后退急性肝中毒、飞腾脑萎缩的白酒伤害、防止肝纤维化等成果、分解甘油三酯、改善高血糖、抑制α-葡萄糖苷酶活性，同时具备体外抗炎熏染等诸多瘦弱成果。

随着“瘦弱中国”睁开火略的拟订以及实施，破费者对于饮酒的态度越来越理性，对于白酒瘦弱层面的需要越来越强烈。由于酱香型白酒的配合工艺特色，瘦弱因子———四甲基吡嗪，依然是钻研的热门。中国工程院孙宝国院士提出“白酒的睁开倾向是瘦弱，瘦弱白酒理当经由‘内寻外加，做作强化’来实现”。在实际酿酒破费历程中，从制曲、聚积或者发酵阶段筛选出高产四甲基吡嗪的微生物，并运用强化到特定的破费发酵阶段，这种方式是罕有的高产四甲基吡嗪的本领。王西等将从高温大曲中筛选患上到的产香枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）运用到酱香型白酒破费中，服从展现聚积组发酵后的糟糕醅中四甲基吡嗪相对于含量抵达6.98 μg/g，是空缺组的4.56倍；王晓丹等将筛选患上到的一株地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）强化到粹沙工艺酱香白酒发酵的酒醅中，发酵后酒醅中的四甲基吡嗪含量是比力组的3.03倍。

以往的钻研，仅运用菌种强化发酵的繁多本领来后退基酒中的四甲基吡嗪含量。本钻研针对于酱香型白酒破费企业的实际破费工艺，比力了3种措施对于酱香型白酒基酒中四甲基吡嗪的含量的影响，即运用菌种强化的方式，在酿酒发酵阶段，经由功能微生物代谢后退基酒中四甲基吡嗪的含量；运用工艺优化方式，将菌剂退出尾酒中浸提患上到高含量四甲基吡嗪的浸提液，在烤酒阶段，经由蒸馏方式（浸提液加之天锅串蒸）使四甲基吡嗪迁移入基酒中；运用菌种强化以及工艺优化摆布开弓的措施。旨在为进一步后退酱香型白酒基酒中四甲基吡嗪的含量提供一种新的、可被企业实际运用的措施以及思绪。 

1 质料与措施

1.1 质料与试剂

1.1.1 菌种以及曲粉

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）M2（MBJ09001）：分说自茅台镇某酒厂高温大曲，珍藏于中国艰深微生物菌种珍藏规画中间，菌种珍藏编号为CGMCC 18734。曲粉：贵州国台酒业五轮次酿酒破费时期的破费用曲粉。

1.1.2 试剂

小麦：某酒厂提供；四甲基吡嗪（色谱纯）：上海麦克林生化科技有限公司；2-乙酰基吡啶（色谱纯）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氯化钠（合成纯）：天津市汇杭化工科技有限公司；无水乙醇（合成纯）：天津市康科德科技有限公司；甲酸（色谱纯）：美国Fluka公司；甲醇（色谱纯）：德国默克公司；卵白胨、酵母浸粉、琼脂粉（均为生化试剂）：北京奥博星生物技术有限责任公司；2-乙基丁酸（色谱纯）：天津市复原详尽化工钻研所。

1.1.3 哺育基

LB液体哺育基：卵白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 10 g，蒸馏水1 000 mL，调pH=7.5，121 ℃低压灭菌20 min。LB固体哺育基：在LB液体哺育基中削减琼脂粉 15 g。

1.2 仪器与配置装备部署

BPS-250HC高温哺育箱：上海申骋仪器科技有限公司；Q-Trap 5500三重四极杆液质联用（high performance liquidchromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）仪：美国ABSCIEX公司；UFLC超高效液相零星：岛津（上海）试验工具备限公司；DGG-101-1BS电热鼓风干燥箱：天津市天宇试验仪器有限公司；DK-S26电热恒温水浴锅：上海森信试验仪器有限公司；LMQ.C-80E立式灭菌器：山东新华医疗工具股份有限公司；IT-09A5磁力搅拌器：上海一恒迷信仪器有限公司。

1.3 试验措施

1.3.1 高产四甲基吡嗪菌剂的制备

菌种活化：从甘油管保存的枯草芽孢杆菌M2中挑取少许菌体，在LB固体哺育基平板上划线，37 ℃哺育18 h，长出单菌落伍挑取单菌落再次划线，以此一再三次，对于菌株妨碍活化以及纯化。一级种子液：从活化后的枯草芽孢杆菌M2平板挑取少许单菌落菌体接种于LB液体哺育基，装液量15 mL/150 mL，37 ℃、200 r/min条件下哺育至妨碍晃动期。二级种子液：将一级种子液按10%（V/V）的接种量接于LB液体哺育基，装液量150 mL/250 mL，37 ℃、200 r/min条件下哺育至妨碍晃动期。固体菌剂制备：称取麦沙（从酒厂制曲车间取患上，与实际制曲破费时破碎捣毁度相同的磨碎的小麦，已经加水，但未削减母曲）以及麦粉（用破碎捣毁机破碎捣毁的小麦粉），装入不锈钢盆中，每一个不锈钢盆中麦粉以及麦沙按品质比1∶1混匀。每一盆3 kg质料中退出300 mL二级种子液（接种量为10%）以及750 mL水，最终水份含量为37.1%。不锈钢盆上拆穿困绕纱布，放入高温哺育箱中妨碍固体哺育。哺育时期，第1天在哺育箱中37 ℃哺育24 h；第2天将哺育温度调解至44 ℃，不断1 d；发酵第3天将哺育温度调解至52 ℃，高温生香坚持2 d；以此条件循环两次制备患上到固体菌剂。发酵历程中审核发酵情景，天天凭证湿度补水、搅拌、丈量温度。

1.3.2 高产四甲基吡嗪菌剂的破费运用方式

菌种强化方式：将制备患上到的菌剂做作干燥后再妨碍磨粉，运用于2019年贵州国台酒业五轮次基酒的破费中，选取了三车间9班8号窖池作为试验窖池，另抉择该班组其余4个窖池作为比力窖池。运勤勉用枯草芽孢杆菌M2制作的固态菌剂（干燥破碎捣毁后）（共10 kg）强化到酱香型白酒聚积发酵停止后、入窖发酵以前窖池的下层糟糕醅中，菌剂与艰深曲粉的品质比为1∶5，跟踪发酵破费历程，经由一个轮次的发酵后（30 d），开窖烤取基酒，评定基酒中四甲基吡嗪的含量以及感官品质的差距。

工艺优化方式：将制备患上到的高含量四甲基吡嗪的菌剂，凭证1∶10的品质比削减到酱香型白酒基酒破费历程发生的头尾酒中，浸泡7 d，取患上头尾酒浸提液，再将头尾酒浸提液替换艰深头尾酒，倒回地锅，经由蒸馏烤酒使患上浸提液中的四甲基吡嗪迁移至基酒中，评定基酒中四甲基吡嗪的含量以及感官品质的差距。

菌种强化散漫工艺优化方式：运用上述菌种强化以及工艺优化相散漫的方式，即在酿酒破费阶段妨碍菌种强化，在蒸馏烤酒阶段妨碍工艺优化。在2019年贵州国台酒业六轮次基酒的破费历程中，选取了一车间1班6号窖池作为试验窖池，该班组其余窖池均为比力窖池。评定基酒中四甲吡嗪的含量以及感官品质的差距。

1.3.3 合成检测措施

（1）四甲基吡嗪的检测措施曲粉/菌剂样品前处置：称取2.8 g破碎捣毁后的曲粉/菌剂样品，退出20 mL体积分数为53%的乙醇溶液，浸泡10 min，25 ℃条件下超声提取30 min，超声功率250 W，超声频率40 kHz，20 ℃、8 000 r/min条件下离心10 min，群集上清液，稀释至适宜倍数后过0.45 μm的有机滤膜，取过滤后样品1 mL于液相样品瓶中，供液质合成。基酒酒样前处置：基酒酒样稀释至适宜倍数后0.45μm的有机滤膜，取过滤后样品1 mL于液相样品瓶中，供液质合成。

接管HPLC-MS检测四甲基吡嗪含量，参考以往文献报道的措施妨碍优化[18-21]，液相色谱条件ACQUITY UPLCBEH C18色谱柱（2.1 妹妹×100 妹妹，1.7 μm），柱温35 ℃；行动相为甲醇：0.1%甲酸=35∶65（V/V）；流速0.4 mL/min；洗脱梯度：0.01～1 min，10%甲醇；1～5 min，35%甲醇。质谱条件：多反映监测（multiple reaction monitoring，MRM）方式，详细参数见表1。

正离子方式下，以四甲基吡嗪尺度品的保存光阴、精确品质数立室，散漫二级特色碎片离子，实现定性合成。接管外标法妨碍四甲基吡嗪的定量合成。 

（2）理化目的检测措施菌剂以及大曲的酸度测定接管酸碱滴定法，糖化力接管胶卷滴定法，详细检测措施参见《白酒破费技术全书》。 

（3）基酒感官品评措施机关4位国家一级品酒师，对于本钻研中的基酒样品妨碍感官品评，分说从曲香、酱香、酒体醇以及度、后味、清洁度这5个维度妨碍打分评估（0～9分，0代表感知不到，9代表特色极为清晰）。

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